सूक्ष्म प्रवर्धन (माइक्रोप्रोपेगैशन)

सूक्ष्म प्रवर्धन से तात्पर्य पौधों के बहुत छोटे भागों, ऊतकों या कोशिकाओं से पौधों के उत्पादन से है, जो नियंत्रित पोषण, पर्यावरण और कीटाणु नाशक स्थितियों में टेस्ट ट्यूब या कंटेनरों में अलैंगिक रूप से उगाए जाते हैं। सूक्ष्म प्रवर्धन  तकनीकों के सभी जैविक सिद्धांत कोशिका की घटना या पूर्ण क्षमता पर आधारित होते हैं, जिसका अर्थ है कि एक पादप कोशिका में विभिन्न अंगों वाले पूर्ण विकसित पौधे के रूप में उत्पन्न होने की क्षमता होती है।

सूक्ष्म प्रवर्धन  बनाम अन्य प्रवर्धन विधियाँ: सूक्ष्म प्रवर्धन  प्रवर्धन अन्य वानस्पतिक प्रवर्धन विधियों से भिन्न होता है:

• एक बहुत छोटे पौधे के भाग (एक्सप्लांट्स) का उपयोग प्रारंभिक सामग्री के रूप में किया जाता है
• एक्सप्लांट्स को सुपरिभाषित कल्चर माध्यम वाले छोटे कंटेनरों में रखा जाता है
• अत्यधिक कीटाणु नाशक स्थितियों की आवश्यकता होती है; तथा
• बहुत कम समय में एक बड़ी प्रवर्धन सामग्री का उत्पादन किया जाता है।

लाभ

• कम समय में अधिक पौधो का उत्पादन
• रोगमुक्त पौधों का उत्पादन
• संकर बीज उत्पादन के लिए पैतृक स्टॉक का क्लोनल प्रवर्धन
• साल भर नर्सरी उत्पादन
• dioecious पौधों के प्रवर्धन में उपयोगी
• प्रजनन चक्र कम हो जाता है
• कठिनाई से प्रवर्धित पौधों की प्रजातियों में उपयोगी
• जर्मप्लाज्म संरक्षण में उपयोगी

नुकसान

• महँगी और परिष्कृत सुविधाओं, प्रशिक्षित कर्मियों और विशेष तकनीकों की आवश्यकता है
• महंगी सुविधाओं और उच्च श्रम निवेश के कारण उत्पादन की लागत उच्च होती है
• संदूषण या कीट के प्रकोप से कम समय में अधिक नुकसान हो सकता है
• दैहिक भिन्नता (somatic variation) का उच्च स्तर
• खेत में पौधों की खराब स्थापन।

सूक्ष्म प्रवर्धन  के चरण

सूक्ष्म प्रवर्धन /उत्तक सवर्धन एक एकीकृत प्रक्रिया है जिसमें चयनित पौधों की कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों को अलग किया जाता है, सतह को रोगाणुरहित किया जाता है और बड़ी संख्या में पौधों का उत्पादन करने के लिए विकास को बढ़ावा देने वाले, रोगाणुरहित माध्यम और परिस्थिति में रखा  किया जाता है। विभिन्न चरण हैं:

चरण 0: पौधों के अलगाव के लिए पैतृक पौधे का चयन: पैतृक पौधा जिसमें से एक्सप्लांट्स का उत्पादन किया जाना है, होना चाहिए

• वांछित प्रजातियों या किस्मों का प्रमाणित और सही प्रकार का प्रतिनिधि।
• स्वस्थ और कीट अथवा रोग से मुक्त
• काफी ओजस्वी होना चाहिए।

चरण 1: कल्चर माध्यम में एक्सप्लांट स्थापना: इस चरण के दौरान ऊतक सक्रियण और गुणन के लिए एक उपयुक्त संवर्धन माध्यम में, अधिमानतः अगार-आधारित मीडिया में संवर्धित किए जाते है।

चरण 2: प्रसार और गुणन: इस चरण में, अधिक प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए बार-बार उप-संवर्धन किया जाता है, जो काफी हद तक विकास नियामकों के संयोजन पर निर्भर करता है। इस चरण की अवधि असीमित है और काफी हद तक प्रवर्धक की पसंद पर निर्भर करती है।

चरण 3: पौधों का स्थापन और जड़ें: इस चरण में चयनित पौधों को जड़ बनाने के लिए मजबूर किया जाता है, जिसे मीडिया संशोधन और विकास नियामकों की एकाग्रता को संशोधित करके प्राप्त किया जा सकता है। साइटोकिनिन और शर्करा की सांद्रता को कम किया जाता है और प्रकाश संश्लेषण और अन्य शारीरिक गतिविधियों को एक साथ शुरू करने के लिए प्रयोगशाला में ऑक्सिन और प्रकाश की तीव्रता को बढ़ाया जाता है।

चरण 4: अनुकूलन या सहिष्णु बनाना: संवर्धन ट्यूबों में विकसित पौधों को उच्च आर्द्रता, कम प्रकाश स्तर और स्थिर तापमान वाले विशिष्ट वातावरण के लिए अनुकूलित किया जाता है। इसके अलावा, संवर्धन ट्यूबों में विकसित जड़ें बाल रहित होती हैं और इसलिए नाजुक होती हैं, जिन्हें संवर्धन माध्यम से स्थानांतरण के दौरान देखभाल की आवश्यकता होती है। बेहतर जीवित रहने की दर के लिए, पौधों को फ़ुहासा कक्षों (mist chamber) में रखे गए कंटेनर में स्थानांतरित किया जा सकता है जहां उच्च सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखी जाती है। एक बार जब नई वृद्धि दिखाई दे जाती है, तो इन पौधों को धीरे-धीरे बाहर की ओर स्थानांतरित किया जा सकता है, जिससे उन्हें प्रकाश की तीव्रता को सहने की क्षमता में वृद्धि हो सके।

एक बार जब पौधे अच्छी तरह से जड़ें जमा लेते हैं, तो उन्हें ग्रीनहाउस वातावरण के अनुकूल हो जाएंगे। संवर्धन ट्यूबों में जड़ वाले पौधों को संवर्धन पात्र से हटा दिया जाता है और संदूषण के संभावित स्रोत को हटाने के लिए आगर को पूरी तरह से धोया जाता है। प्लांटलेट्स को एक मानक पास्चुरीकृत रूटिंग या मिट्टी के मिश्रण में छोटे बर्तनों या सेल में कम या ज्यादा पारंपरिक तरीके से प्रत्यारोपित किया जाता है। प्रारंभ में, सूक्ष्म पौधों को छायांकित, उच्च आर्द्रता वाले टेंट में या फुहासा या कोहरे के द्वारा सूखने से बचाया जाना चाहिए। नई कार्यात्मक जड़ें बनने के लिए कई दिनों की आवश्यकता हो सकती है।

प्लांटलेट्स को धीरे-धीरे कम सापेक्ष आर्द्रता और उच्च प्रकाश तीव्रता के संपर्क में लाया जाना चाहिए। कोई भी निष्क्रियता या आराम की जो स्थिति विकसित होती है उसे स्थापना प्रक्रिया के हिस्से के रूप में दूर करने की आवश्यकता हो सकती है। ये स्थितियां पौधों को प्राकृतिक परिस्थितियों के अनुकूल होने में मदद करती हैं, जिससे उन्हें आसानी से खेत में स्थापित होने में भी मदद मिलती है।

संवर्धन तकनीक

विभिन्न संवर्धन तकनीकें जैसे (i) मेरिस्टेम कल्चर (ii) कैलस कल्चर (iii) शूट बड रीजनरेशन (iv) सोमैटिक एम्ब्रियोजेनेसिस (v) डिंब कल्चर (vi) एम्ब्रियो कल्चर (vii) एथेर कल्चर और (viii) प्रोटोप्लास्ट कल्चर, सूक्ष्म प्रवर्धन  में काम ली जाती हैं।

1. मेरिस्टेम कल्चर: मेरिस्टेम कल्चर में शूट-टिप और एक्सिलरी-बड दोनों का संवर्धन शामिल है। सबसे पहले 1950 के दशक में मोरेल द्वारा, मेरिस्टेम-टिप-संवर्धन के रूप में जानी जाने वाली तकनीक का आधार एक या दो पत्ती प्राइमोर्डिया (0.1-0.5 मिमी) के साथ शिखर गुंबद से युक्त छोटे शूट-टिप्स का उपयोग किया। मेरिस्टेम टिप कल्चर अब नियमित रूप से मुख्य रूप से बागवानी फसलों में संक्रमित सामग्री से वायरस के उन्मूलन के लिए उपयोग किया जा रहा है। जाहिर तौर पर वायरस या तो आसानी से आक्रमण नहीं करता है या युवा मेरिस्टेमेटिक ऊतक में तेजी से गुणाण नहीं करता है। कैलस के गठन को कम करने के लिए केवल लवण, सुक्रोज और विटामिन से युक्त एक साधारण पोषक माध्यम का उपयोग किया जाता है। पर्याप्त वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए अक्सर जिबरेलिक एसिड की आवश्यकता होती है और जड़ गठन को प्रोत्साहित करने के लिए NAA की आवश्यकता हो सकती है।
2. कैलस कल्चर: जीवित कोशिकाओं के रोगाणुरहित पौधे के ऊतक का एक टुकड़ा कैलस प्रसार को प्रेरित करने के लिए संवर्धन माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है। उप-संवर्धन तब विकास नियामक सांद्रता के साथ या बिना एक माध्यम पर किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः बाहरी अंगों या भ्रूणों को पैदा किया जाता है। अंतिम चरण में, पुनर्जीवित पौधों को इन विट्रो कल्चर से हटा दिया जाता है और धीरे-धीरे बाहरी वातावरण के संपर्क में लाया जाता है ताकि पौधे पूरी तरह से स्वपोषी हो सकें।
3. कोशिका कल्चर: कोशिकाओं को निलंबन संवर्धन में बनाए रखा जाता है ताकि मुक्त कोशिकाओं का उत्पादन किया जा सके और फिर एकल कोशिकाओं से पूर्ण पौधों को पुन: उत्पन्न करने के लिए उप-संवर्धित किया जाता है। यह तकनीक अब पादप कोशिकाओं में परिवर्तनशीलता को प्रेरित करने और वांछित कोशिका प्रकारों का चयन करने और इन प्रकारों से पूर्ण पौधों को पुन: उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है।
4. भ्रूण कल्चर: इसमें भ्रूण को रोगाणुरहित तरीके से काटना और इष्टतम संवर्धन परस्थितियों में विकास के लिए एक उपयुक्त माध्यम में उसका स्थानांतरण शामिल है। भ्रूण के इन विट्रो में एक पौधे के रूप में विकसित होने के बाद, इसे रोगाणुरहित मिट्टी या वर्मीक्यूलाइट में स्थानांतरित कर दिया जाता है और एक ग्रीन हाउस में परिपक्वता के लिए उगाया जाता है। यह तकनीक इंटरस्पेसिफिक (interspecific) और इंटरजेनेरिक (intergeneric) संकरों के उत्पादन में उपयोगी है जिनको अन्यथा पूरा नहीं किया जा सकता है और भ्रूण गर्भपात पर काबू पाने में भी उपयोगी है।
5. प्रोटोप्लास्ट कल्चर: विभिन्न स्रोतों से, प्रोटोप्लास्ट (पौधे बिना किसी कठोर सेल्युलोज दीवार के लेकिन प्लाज्मा झिल्ली के साथ केवल एक दैहिक संकर बनाने के लिए मिलाप की अनुमति दी जाती है) कोशिका की दीवार को पुन: उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त मीडिया में संवर्धित किये जाते हैं और फिर से विभेदन और रूपजनन के लिए एक उपयुक्त माध्यम में संवर्धित किये जाते हैं ।
6. परागकोश कल्चर: परागकोषों की संवर्धन प्रजनकों के लिए काफी महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे अगुणित पौधों का उत्पादन संभव है जो पुनरावर्ती एलील (recessive alleles) को प्रकट करते हैं। इन अगुणित पौधों का उपयोग समयुग्मजी द्विगुणित के उत्पादन के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार इनब्रीडिंग की पीढ़ियों से बचा जा सकता है। अतिरिक्त लाभ, जैसे कि छोटे फूल और लंबे समय तक फूलने का समय, अगुणित पौधों के उपयोग से सुनिश्चित किया जा सकता है क्योंकि वे आमतौर पर अपने द्विगुणित समकक्षों की तुलना में छोटे होते हैं और बाँझ होने के कारण परागण प्रेरित बुढ़ापा नहीं होगा। पेलार्गोनियम प्रजाति में एथेर कल्चर का उपयोग वायरस को खत्म करने के लिए, लिलियम प्रजाति में अगुणित पौधों का उत्पादन करने के लिए और जरबेरा में विभिन्न फूलों के रंग प्राप्त करने के लिए किया जाता है।
7. दैहिक भ्रूणजनन (Somatic embryogenesis): क्लोनल गुणन की सबसे बड़ी क्षमता दैहिक भ्रूणजनन के माध्यम से होती है, जहां तकनीकी रूप से एक एकल पृथक कोशिका पहले एक भ्रूण, फिर एक पूर्ण पौधे का उत्पादन कर सकती है। बागवानी पौधों की विभिन्न प्रजातियों में दैहिक भ्रूणजनन और प्लांटलेट पुनर्जनन मध्य-रिब, पत्ती और स्टेम कैलस का उपयोग MS आधारी माध्यम पर जिसे 0 – 2.0 मिलीग्राम / लीटर 2,4-D और 0.25-0.50 मिलीग्राम / लीटर BA या किनेटिन से संशोधित /पोषित करके किया जाता है।

संवर्धन के माध्यम

ऊतक संवर्धन विधियों की प्रौद्योगिकी और अनुप्रयोग में सफलता उचित संवर्धन माध्यम के चयन पर निर्भर करती है, जो संवर्धित कोशिकाओं और ऊतकों की पोषण संबंधी आवश्यकताओं को पूरा करता है। सभी पोषक माध्यमों के मूल घटक अकार्बनिक लवण, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन, वृद्धि नियामक, अगार (ठोस माध्यम के लिए) और पानी हैं। कार्बनिक नाइट्रोजनस यौगिकों, कार्बनिक अम्लों और जटिल पदार्थों सहित अन्य घटक महत्वपूर्ण हो सकते हैं लेकिन वैकल्पिक हैं।